蛋白质热稳定性是衡量其结构完整性与功能保持能力的关键指标，广泛应用于基础研究、蛋白工程和生物药开发等多个领域。圆二色谱（Circular Dichroism, CD）是一种敏感、快速且低样本量的光谱技术，常用于分析蛋白质二级结构的构象变化，特别适合评估热变性行为和熔点（Tm）等热稳定性参数。

一、CD技术在蛋白质热稳定性分析中的作用

圆二色谱是依赖手性分子对左右旋圆偏振光吸收差异的光谱技术。对于蛋白质而言，其二级结构（如α-螺旋、β-折叠）会在190–250nm的远紫外区域产生特征性CD信号。例如，α-螺旋通常在208nm与222nm附近显示双重负峰，而β-折叠结构在216nm左右表现为负峰。当温度升高导致蛋白质发生热变性时，其原有的有序结构被破坏，CD光谱的特征信号会发生显著变化。因此，通过监测不同温度下蛋白的CD信号，尤其是222nm处椭圆率值的变化，可精确描绘蛋白热解构过程，进一步计算熔点Tm值，反映其热稳定性。

二、实验设计与操作关键点

为获得可靠的CD热变性数据，实验设计需要充分考虑样品特性、缓冲体系、波长选择与升温条件等多重因素。

1、蛋白样品制备

样品纯度和均一性对实验结果至关重要。推荐使用纯度＞90%的蛋白质，避免聚集体或多态性干扰。缓冲液应具备良好的热稳定性和低紫外吸收，常用如PBS、HEPES等，避免使用Tris等温度敏感缓冲液。蛋白浓度一般控制在0.1–0.5mg/mL，确保获得良好的信噪比。

2、波长选择

热变性实验通常选择222nm作为主要监测波长，因其对α-螺旋结构变化最敏感。对β-折叠结构丰富的蛋白，也可关注216nm波长处的变化。完整的远紫外CD光谱（190–250nm）可用于变性前后结构比较，辅助判断变性过程的方向与程度。

3、温度范围与升温速率

温度通常从10°C起，逐渐升高至90–95°C，具体依据蛋白质的预期稳定性设定。升温速率建议控制在0.5–1°C/min，保证系统热平衡，避免数据偏差。每隔1–2°C记录一个数据点，可描绘出平滑的温度-椭圆率曲线。

4、可逆性测试

在部分研究场景中，评估蛋白变性过程是否可逆具有重要意义。可在完成升温扫描后，将样品缓慢冷却至初始温度，再重新采集CD光谱，与加热前光谱比较。若结构能够恢复，说明变性过程具有一定可逆性，适用于构象可恢复的天然蛋白或某些工程蛋白设计的评价。

三、数据解读与Tm计算方法

CD热变性实验的结果通常表现为典型的S型曲线：初始阶段蛋白结构稳定，椭圆率信号保持恒定；随着温度升高，蛋白逐步解构，椭圆率急剧下降；最终趋于平台，代表完全变性状态。

Tm值提取

Tm值是热稳定性分析的核心参数，表示蛋白质失去一半有序结构的温度。常采用双态转变模型（two-state transition model）对热变性曲线进行非线性拟合，假设蛋白在“天然态”与“变性态”之间直接转化。通过拟合可准确获得Tm值及协同性参数，量化热变性过程。对于多结构域或多稳定态蛋白，变性过程可能涉及多个Tm，需根据曲线形态与波峰/拐点位置综合判断，或辅以多波长分析提高解析能力。

四、实验中常见问题及优化建议

1、信号波动或曲线不连续

可能由缓冲液干扰、蛋白聚集或气泡引起。应确保缓冲液经脱气处理、使用匹配的石英比色皿，并在样品制备后短时间内完成实验。

2、Tm值重复性差

需检查升温系统稳定性、样品是否降解或缓冲系统是否失效。建议每个样品重复测试至少3次，确认Tm值具有统计意义。

3、解构不完全或无明显转变

可能是蛋白质极度稳定，Tm超出检测上限；也可能蛋白本身构象柔性高，热诱导不显著。此时可尝试延长升温范围、调节缓冲环境，或考虑联合化学变性策略如尿素诱导。

圆二色谱技术作为蛋白质热稳定性研究的重要工具，因其对二级结构敏感、操作简便、样品消耗低等特点，已广泛应用于天然蛋白质、重组蛋白及突变体构象稳定性的评估。通过优化实验条件与数据分析方法，科研人员可快速、精准地获取Tm等关键参数，从而为蛋白质功能机制解析、工程优化与药物研发提供强有力的数据支持。在CD分析及蛋白稳定性研究领域，百泰派克生物科技凭借先进的仪器平台和规范化实验流程，致力于为科研人员提供高质量的蛋白质圆二色谱分析服务，助力您揭示蛋白构象背后的生物学意义。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!

>>点击了解更多优质服务项目